Twin-cantilevers: un sistema innovativo per la rivelazione dell'ibridizzazione del DNA su singola molecola
Autore
Elena De Marchi - Università degli Studi di Trieste - [2004-05]
Documenti
Abstract
Scopo di questo lavoro di tesi è stata la progettazione, lo sviluppo, la realizzazione e la caratterizzazione di un innovativo sistema microelettromeccanico (MEMS) per la rivelazione e la manipolazione di singole molecole di DNA, basato sull’utilizzo di una coppia di cantilever identici, chiamati twin-cantilevers, l’uno affacciato all’altro, separati da una apertura di dimensione nanometrica.
Il lavoro svolto si inserisce in un contesto, quello dello studio delle proprietà meccaniche di singole molecole di DNA, che ha visto uno sviluppo vertiginoso negli ultimi anni. L’enorme interesse per questa biomolecola può essere compreso considerando le importanti informazioni che essa contiene sul patrimonio genetico umano e i risvolti che la sua approfondita conoscenza può avere in ambito medico, oltre alle numerose, e talvolta fantasiose, applicazioni tecnologiche che sono state proposte.
Da diversi anni ormai sono stati sviluppati MEMS per la rivelazione dell’ibridizzazione del DNA, la reazione chimica durante la quale una sequenza single-stranded si lega alla sua complementare per formare la nota struttura double-stranded a doppia elica. Tali sistemi sono per lo più costituiti da array di cantilever che rivelano il processo di ibridizzazione attraverso la deflessione che quest’ultima comporta. Tuttavia i dispositivi finora proposti si basano sull’uso di cantilever singoli, adatti alla rivelazione di grandi quantità di molecole target o di un numero limitato di molecole formate da sequenze particolarmente lunghe. Spesso inoltre la selettività di tali sistemi si è dimostrata inferiore alle aspettative.
La particolare configurazione che viene proposta in questa tesi permette invece, almeno in linea di principio, la rivelazione di un singolo evento di ibridizzazione, con la conseguenza di poter ridurre la probabilità di errore a zero.
Il principio di funzionamento del sistema twin-cantilever per la rivelazione di un evento di ibridizzazione è il seguente: una breve e specifica sequenza di DNA single-stranded (molecola probe) è ancorata da entrambi i lati alle estremità libere dei due cantilever componenti il sistema twin-cantilever; quindi una popolazione di molecole di ssDNA, la cui composizione è ignota, viene immessa in soluzione. Se la sequenza ignota corrisponde alla sequenza complementare alla molecola probe, l’ibridizzazione nella struttura a doppia elica comporta la formazione di un ponte tra i due cantilever sufficientemente rigido da modificare le proprietà meccaniche del sistema e, in particolare, la sua frequenza di risonanza. Una misura di opportuna sensibilità della frequenza di risonanza consente di verificare l’avvenuta ibridizzazione, e quindi di conoscere la sequenza della molecola ignota.
La progettazione e la realizzazione dei MEMS e del sistema ottico di lettura sono state svolte presso il Laboratorio TASC CNR-INFM di Trieste.
Sistemi MEMS di cantilever singoli e twin-cantilevers sono stati realizzati a partire da wafer SOI (Silicon on Insulator) utilizzando tecniche di micromachining del Silicio.
La fabbricazione ed il controllo nanometrico dell’apertura tra i due cantilever è stata effettuata prima generando meccanicamente una frattura nel silicio monoscristallino e quindi regolando la dimensione dell’apertura flettendo meccanicamente il substrato di silicio, con una tecnica già utilizzata nella fabbricazione delle mechanical break junctions.
Infine, per la lettura dell’oscillazione del sistema twin-cantilever è stato realizzato un sistema ottico, costituito da un raggio laser puntato sulla superficie dei cantilever e riflesso da questa su un diodo fotosensibile.
Nella presente tesi viene fatta dapprima una breve introduzione sulla tecnologia dei cantilever, seguita da un resoconto dei principali dispositivi realizzati finora. Al secondo capitolo viene spiegato il principio di funzionamento del sistema twin-cantilever e ne viene riportata la simulazione agli elementi finiti, seguita dalla progettazione e dal dimensionamento. Nel terzo capitolo vengono descritti tutti i processi di microfabbricazione eseguiti in clean room che hanno portato alla realizzazione del dispositivo. Infine, nell’ultimo capitolo, viene descritto il set-up del sistema ottico di lettura dell’oscillazione e vengono riportati i risultati ottenuti dalle misure effettuate sui campioni realizzati.
Il lavoro svolto si inserisce in un contesto, quello dello studio delle proprietà meccaniche di singole molecole di DNA, che ha visto uno sviluppo vertiginoso negli ultimi anni. L’enorme interesse per questa biomolecola può essere compreso considerando le importanti informazioni che essa contiene sul patrimonio genetico umano e i risvolti che la sua approfondita conoscenza può avere in ambito medico, oltre alle numerose, e talvolta fantasiose, applicazioni tecnologiche che sono state proposte.
Da diversi anni ormai sono stati sviluppati MEMS per la rivelazione dell’ibridizzazione del DNA, la reazione chimica durante la quale una sequenza single-stranded si lega alla sua complementare per formare la nota struttura double-stranded a doppia elica. Tali sistemi sono per lo più costituiti da array di cantilever che rivelano il processo di ibridizzazione attraverso la deflessione che quest’ultima comporta. Tuttavia i dispositivi finora proposti si basano sull’uso di cantilever singoli, adatti alla rivelazione di grandi quantità di molecole target o di un numero limitato di molecole formate da sequenze particolarmente lunghe. Spesso inoltre la selettività di tali sistemi si è dimostrata inferiore alle aspettative.
La particolare configurazione che viene proposta in questa tesi permette invece, almeno in linea di principio, la rivelazione di un singolo evento di ibridizzazione, con la conseguenza di poter ridurre la probabilità di errore a zero.
Il principio di funzionamento del sistema twin-cantilever per la rivelazione di un evento di ibridizzazione è il seguente: una breve e specifica sequenza di DNA single-stranded (molecola probe) è ancorata da entrambi i lati alle estremità libere dei due cantilever componenti il sistema twin-cantilever; quindi una popolazione di molecole di ssDNA, la cui composizione è ignota, viene immessa in soluzione. Se la sequenza ignota corrisponde alla sequenza complementare alla molecola probe, l’ibridizzazione nella struttura a doppia elica comporta la formazione di un ponte tra i due cantilever sufficientemente rigido da modificare le proprietà meccaniche del sistema e, in particolare, la sua frequenza di risonanza. Una misura di opportuna sensibilità della frequenza di risonanza consente di verificare l’avvenuta ibridizzazione, e quindi di conoscere la sequenza della molecola ignota.
La progettazione e la realizzazione dei MEMS e del sistema ottico di lettura sono state svolte presso il Laboratorio TASC CNR-INFM di Trieste.
Sistemi MEMS di cantilever singoli e twin-cantilevers sono stati realizzati a partire da wafer SOI (Silicon on Insulator) utilizzando tecniche di micromachining del Silicio.
La fabbricazione ed il controllo nanometrico dell’apertura tra i due cantilever è stata effettuata prima generando meccanicamente una frattura nel silicio monoscristallino e quindi regolando la dimensione dell’apertura flettendo meccanicamente il substrato di silicio, con una tecnica già utilizzata nella fabbricazione delle mechanical break junctions.
Infine, per la lettura dell’oscillazione del sistema twin-cantilever è stato realizzato un sistema ottico, costituito da un raggio laser puntato sulla superficie dei cantilever e riflesso da questa su un diodo fotosensibile.
Nella presente tesi viene fatta dapprima una breve introduzione sulla tecnologia dei cantilever, seguita da un resoconto dei principali dispositivi realizzati finora. Al secondo capitolo viene spiegato il principio di funzionamento del sistema twin-cantilever e ne viene riportata la simulazione agli elementi finiti, seguita dalla progettazione e dal dimensionamento. Nel terzo capitolo vengono descritti tutti i processi di microfabbricazione eseguiti in clean room che hanno portato alla realizzazione del dispositivo. Infine, nell’ultimo capitolo, viene descritto il set-up del sistema ottico di lettura dell’oscillazione e vengono riportati i risultati ottenuti dalle misure effettuate sui campioni realizzati.
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